SOUTHERN PROBE DNA PREPARATION

IRS-1

����������� 1.�������� Grow up bacteria (use amp LB) from glycerol stocks

����������� 2.�������� Use a Qiagen prep to purify the DNA

����������� 3.�������� Digest plasmid DNA as follows:

����������������������� 25 ml DNA

����������������������� 2.5 ml Xba1

����������������������� 2.5 ml BamH1

����������������������� 3.0 ml Buffer 4

����������������������� 0.5 ml BSA

����������� 4.�������� Digest for 2 hours at 37�C

����������� 5.�������� Run digest on a 2% low-melt gel

����������� 6.�������� Excise the 300 b.p. band

����������� 7.�������� Use Mermaid kit to clean (use ~ 10 ml GlassFOG)

����������� 8.�������� Re-suspend in ~20 ml of sterile water

IRS-2

����������� 1.�������� Prepare PCR reaction:

����������������������� 5 ml buffer

����������������������� 1 ml dNTP mix

����������������������� 2 ml 3� primer (with green tape)

����������������������� 2 ml 5� primer (with green tape)

����������������������� 0.5 ml Taq

����������������������� 2 ml IRS-2 probe DNA

����������������������� 37.5 ml sterile water

����������� 2.�������� PCR profile:

����������������������� 94�C for 5 minutes

����������������������� 94�C for 1 minute

����������������������� 60�C for 1 minute��������������������������������� 30 cycles

����������������������� 72�C for 1 minute

����������������������� 72�C for 10 minutes

����������������������� 4�C for 1 hour

����������� 3.��������

STF

����������� 1.�������� Grow up bacteria and purify DNA via Qiagen prep

����������� 2.�������� Digest as follows:

����������������������� 2.5 ml Xba1

����������������������� 2.5 ml EcoR1

����������������������� 5 ml buffer 2

����������������������� 0.5 ml BSA

����������������������� 25 ml DNA

����������� 3.�������� Run digest on 2% low-melt gel.

����������� 4.�������� Excise which band?

����������� 5.�������� Purify with GeneClean or Mermaid kit?

IGF

����������� 1.�������� Digest plasmid with BamH1 and HincII

����������� 2.�������� Excise 460 b.p. band

IMM

����������� 1.�������� Plasmid is RSVTEK

����������� 2.�������� Digest as follows:

����������������������� 30 ml DNA

����������������������� 10 ml Pst1

����������������������� 10 ml buffer 3

����������������������� 50 ml sterile water

����������� 3.�������� Digest at 37�C for 2 hours

����������� 4.�������� Run on 2% low-melt gel

����������� 5.�������� Excise 1.6 kb band

�����������