PROTOCOLS 1
B:WGAAUTO.SAM�
7/25/92
WGA-IR AUTOPHOSPHORYLATION
1.� Reaction is 50 ul:
-- 3-4 ug (10-20 ul)
WGA-IR
-- 2.5 ul MnCl2 (100
mM)
-- 5 ul 10-6 M
insulin or water
-->volume to 45 ul with
50 mM Hepes pH 7.4 containing 0.1% Triton X-100 (H/T)
� (Preincubate 15' room temp to allow insulin binding)
-- 5 ul 500 uM ATP
containing 20-30 uCi g-[32P]-ATP.
� (Incubate 20 minutes room temperature)
����������������������� ����������������������� ����������� Common variables:� ����������� insulin
concentration,
����������������������� ����������������������� ����������������������� ����������� ����������� ATP
concentration
����������������������� ����������������������� ����������������������� ����������� ����������� time of
incubation
2.� Stop the reaction (two methods):
a)� Laemmli-ize the sample and load directly
-- add 50 ul of 2x Laemmli
Sample buffer to each reaction.� Close
the tube, use a 21 ga needle to put a hole in the lid and boil in water bath
for 5 minutes.� Load to gel (7.5% SDS-PAGE),
careful no to slop, bubble, or you will fog the gel.� Bottom gel buffer is hot waste.
b)� Immunoprecipitate the sample:� ����������������������� ����������� 50 mls:
-- add 500 ul of IP
buffer:� ����������� H/T containing �������
����������������������� ����������� ����������� 2 mM Vanadate��������� ����������� 18 mg
����������������������� ����������������������� ����������� NaF���������������� ����������� 210
mg
����������������������� ����������� ����������� 2 mM PMSF������������� ����������� 500 ul
of stock
����������������������� ����������� ����������� 5 mM EDTA������������� ����������� 500 ul
of 0.5 M
--� add 20 ul/reaction of anti-PY or anti-IR
antibodies, allow to bind 2 hrs-overnight a 4oC.
--� add 100 ul/reaction of pansorbin.� > 1 hour 4oC.
--� spin down 2 minutes in microfuge, aspirate
supernatant (hot waste).� Add 1 ml
Tris-SDS IP wash, sonicate.� Repeat 2
additional times.� Aspirate supernatant,
add 70 ul of laemmli sample buffer.
--� boil 5', vortex
to resuspend pellet, boil 3'.� Spin down
pansorbin 5', load supernatant to gel.